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抗体人性化

vwin具有丰富的经验,为治疗和诊断的发展提供抗体人性化服务。在过去十年中,我们成功地完成了15个小鼠/大鼠的人化项目,至少有一种人化抗体进入临床试验。我们还为来自其他物种的抗体提供人性化服务,如非人类的灵长类动物(额定马力),兔子狗,鸡美洲驼等。

人源化对于降低来源于异种源(通常是啮齿动物)的单克隆抗体的免疫原性和提高其对人类免疫系统的激活具有重要意义。自从杂交瘤技术的发展,大量的啮齿动物单克隆抗体对治疗感兴趣的抗原有特异性,已被产生和鉴定。啮齿动物抗体对人体具有高度免疫原性,这限制了他们的临床应用,尤其是需要反复用药时。重要的是,它们会迅速从血液循环中清除,并可能引起全身炎症效应。作为规避这些问题的一种手段,我们开发了三种抗体人化策略,可以保留抗体对抗原的特异性和亲和力,同时显著或完全消除抗体在人类中的免疫原性。第一种方法是CDR嫁接,第二种方法是链疏解。这两种方法都是基于人源化scfv变异体的噬菌体展示和通过生物淘选选择高亲和力的人源化结合物。第三种方法,人性化的igg库筛选,是独一无二的。我们将制作一个人源化的整体免疫球蛋白库,将其展示在哺乳动物细胞表面,然后将高亲和力的结合物按facs分类。

CDR嫁接和SDR嫁接

建立了互补决定区嫁接平台,其特点是利用噬菌体显示技术和计算机建模对一小组框架残体进行随机分组。在这个平台上,6个包含抗原结合位点的cdr环被移植到相应的人体框架区域。不幸的是,将啮齿动物的CDR简单地移植到人的框架中并不总是能重建原抗体的结合亲和力和特异性,因为框架残基与抗原结合有关。或者间接地,通过支持CDR循环的构造,或直接,通过接触抗原。因此,我们开发了一种计算机建模方法来随机化某些框架残基以及CDR嫁接。将嫁接的CDR与随机残基一起克隆到噬菌体展示库中,筛选出亲和力最佳的人源化抗体。这种方法可以保留原抗体的表位特异性。值得注意的是,这种方法的人性化并不是100%,因为CDR区域仍然起源于啮齿动物。

人性化CDR SDR嫁接

为了降低CDR移植人源化抗体的免疫原性,通过SDR移植,使cdr移植的人源化抗体中的小鼠含量降到最低。在每个CDR中,有更多的可变位置直接参与与抗原的相互作用,即。,特异性测定残留物(SDR)而有更多的保守残基维持了cdrs环的构象。SDR可从抗原抗体复合物的3D结构和/或CDR的突变分析中识别。通过将SDR和保持CDR构象的残基嫁接到人体模板上,构建了SDR嫁接人源化抗体。并通过检测经父母抗体免疫的患者对血清的反应性来评价其免疫原性。

链改组

在构建和筛选两个嵌合噬菌体展示库的基础上,优化了一种完全选择性的人性化连锁洗牌策略。在这种方法中,啮齿动物抗体的轻链首先被我们一个经过良好测试的人类抗体库中的轻链所取代;然后通过对特定抗原进行淘选来筛选产生的杂交抗体库。之后,所选杂交抗体的重链被人类抗体库的重链所取代。随后对这种二次嵌合文库的筛选将产生完全人源化的抗体。因为噬菌体展示库筛选模仿体内抗体选择和进化程序,链洗脱可导致人源化抗体的亲和力高于原抗体。也,这种顺序链洗脱程序可以产生不同序列的人源化抗体的几种版本。在需要用抗体长期治疗的治疗方案中,产生多个保持相同表位特异性的人源化抗体是很重要的,在这种治疗方案中,可通过注射替代抗体来避免抗独特型反应。

如上所述,基于嵌合噬菌体展示库构建和筛选的“链疏解”方法,可以充分发挥其功能。即100%人源化小鼠抗体。我们建议使用我们的HUSCL-2TM噬菌体展示原始人scfv库,复杂度1.42×10作为嵌合文库的主干和人类病毒供体的转化体lVH链。

人性化的igg库筛选

在这种方法中,一个哺乳动物细胞表面显示库是为了显示全尺寸的人源化的igg变种,进一步选择使用facs。第一,我们将选择一个接受人VH和受体Vl基于一致序列的人类抗体亚群。下一步,如上文所述进行CDR嫁接。为了增加(或保持)人源化抗体的亲和力,哺乳动物细胞表面显示IGG库被创建来显示人类化IGG的所有可能变体。由于哺乳动物细胞表面显示IgG库的大小限制,必须决定哪些氨基酸要多样化,在多大程度上使浪费库容量的无意义抗体突变体减少。框架区域的反向突变是基于计算机建模或抗原/抗体结构信息设计的。也,我们将区分有溶剂可接触侧链和埋侧链的残留物。我们已经证实,具有埋藏侧链的残基随机化是对库序列空间的浪费。也,我们不突变甘氨酸和色氨酸,因为这些残基的变化通常会取消结合。有时,我们研究了母体抗体的aa序列,以找出保守的框架位置(与生殖系和抗体亚家族序列比较)。然后我们可以将突变引入不保守的框架结构区域的位置。据称,这些区域具有抗原特异性,这些区域的变化可能增加亲和力,但不增加免疫原性。为了创建一个最大的图书馆,采用Trimer密码子技术对人源化重链和人源化轻链上的框架残基进行随机分组。

最后,创建了人性化的igg库,其中,重链变异体的cDNA(其位置用三聚体密码子随机排列)被克隆到哺乳动物细胞表面显示载体中,而轻链变异体的cDNA被插入到单独的哺乳动物表达载体中,以游离形式表达(不是膜锚定蛋白)。然后将重链库和轻链库的cDNA混合并导入293个细胞中,用于功能性全尺寸人源化IgG变体的表面显示。然后,顶部的活页夹按FAC排序。经过严格的选择,部分酶联免疫吸附试验阳性突变体结合物的亲和力高于母体抗体。利用表面等离子体共振仪双核对阳性克隆的亲和力进行排序。前3-5个克隆将被表达和纯化,以测量亲和力。

这种方法可以选择全尺寸的人源化抗体,保留或增加小鼠抗体的原亲和力。也,与上述基于细菌噬菌体展示的方法相比,这种哺乳动物细胞表面显示方法允许选择高亲和力的人源化抗体的二聚体IgG格式;所选的IgG可立即用于进一步的下游应用,避免scfv转化为IgG的耗时,以及转化后的IgG的密码子优化(用于哺乳动物细胞的表达)。有时会取消选择一些人性化的scfv。也,一些好的抗体具有阻止蛋白质合成和噬菌体在细菌细胞中显示的序列;这些问题可以很好地克服在这个专门的哺乳动物细胞为基础的系统。

人性化CDR SDR嫁接

我们人性化服务的特点

抗体人性化服务有两个特点,使我们从同行中脱颖而出。首先,抗体亲和力成熟是人类化过程中的一个综合步骤。因此,在人性化之后,不需要提高亲和力。其次,除了常用的计算和生化方法外,我们开发了一个专有的体内评价灵长类人源化抗体免疫原性的方法。灵长类动物所测得的免疫原性是最接近的一种,它可以模拟人体抗体的真正免疫原性。




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