噬菌体展示和抗体图书馆服务gydF4y2Ba

通过噬菌体展示技术开发抗体-常见问题gydF4y2Ba

噬菌体展示-一般问题gydF4y2Ba
平移和筛选相关问题gydF4y2Ba
预制噬菌体库相关问题gydF4y2Ba
抗原相关问题gydF4y2Ba
免疫相关问题gydF4y2Ba
噬菌体衍生抗体相关问题gydF4y2Ba
噬菌体展示抗体库构建的相关问题gydF4y2Ba
故障排除gydF4y2Ba

噬菌体展示-一般问题gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问：噬菌体展示是什么？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba噬菌体展示是一种选择技术，在这种技术中，肽或蛋白质的变体库在噬菌体病毒粒子的外部表达，而编码每个变体的遗传物质则驻留在噬菌体病毒粒子的内部。这就在每个变异蛋白质序列和编码它的DNA之间建立了一个物理联系，从而允许通过一个分子与给定目标分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的结合亲和力进行快速分割gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba选择过程称为“生物淘洗”。生物淘洗是通过将噬菌体展示的变体池与固定在平板或珠上的目标物孵育，洗去未结合的噬菌体，并洗脱特异性结合的噬菌体来进行的。然后，洗脱的噬菌体被扩增gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba重复这个过程，导致噬菌体库逐步富集，有利于最紧密的结合序列。经过3-4轮选择/扩增后，通过DNA测序确定单个克隆的特征。gydF4y2Ba

2. 问：与其他抗体开发方法相比，噬菌体展示筛选有哪些优势？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba与杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术具有很大的优势。杂交瘤方法仅适用于小鼠，大鼠，仓鼠和豚鼠。另一方面，噬菌体展示可用于产生来自所有流行抗体生产物种的高亲和力单克隆抗体，包括但不限于人，小鼠，大鼠，兔子，鸡肉，骆驼，骆驼，羊驼，牛，狗，羊，猴子和鲨鱼。杂交瘤的单克隆抗体显影只能生成一次少量针对特定免疫原的抗体候选物;虽然噬菌体展示技术可以呈现整个抗体曲目（例如10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba)，其中近10%的抗体是免疫原特异性的。有了这样一个巨大的潜在结合物池，利用噬菌体展示技术发现所需特性的抗体的机会就大得多。此外，使用杂交瘤技术，很难加入一个富集步骤，可以选择性分离具有所需功能的抗体。在大多数情况下，首先产生所有杂交瘤克隆，然后逐个验证。相反，噬菌体展示技术允许多种富集策略:具有所需特性的抗体可以被富集，因此没有所需功能的抗体可以被排除在进一步验证之外。例如，抗体库筛选可以使用靶标捕获强结合物，同时使用对照物阻断/耗尽交叉反应结合物。总之，这种免疫抗体库方法可以收集动物体内几乎所有的抗体，并从这些抗体中分离出最强的结合物。此外，反选择可以很容易地被纳入。gydF4y2Ba

3. 问:M13、T7、T4显示系统有什么区别?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2BaM13丝状噬菌体gydF4y2Ba一直是最受欢迎的选择，并广泛用于各种类型的研究，以及许多其他类型的噬菌体。病毒外壳由5种不同的衣壳蛋白组成，包括一个主衣壳pVIII(2700个拷贝)和4个小衣壳(一端是pIII和pVI，另一端是pVII和pIX)。与T4和T7不同，M13是溶源噬菌体，它组装在胞质周围，并从菌膜中分泌出来而不溶解宿主。gydF4y2Ba

   M13噬菌体上的多衣壳蛋白允许对各种具有独特特征的肽和蛋白质进行综合展示选择。所有五个衣壳都已成功用于具有唯一载体的外域显示。pIII和pVIII是M13噬菌体展示的首选。gydF4y2Ba

   噬菌体T4gydF4y2Ba在许多方面与M13不同。T4有更大的尺寸，尾部结构和双链DNA (dsDNA)基因组编码50种不同的蛋白质。更大的基因组DNA允许更大的外来蛋白质插入。在非必需外壳蛋白HOC和SOC上可以显示出两个不同的结构域。N端和c端插入均可。T4噬菌体无膜分泌过程，可避免宿主毒性和确认性改变。gydF4y2Ba

   T7噬菌体gydF4y2Ba与丝状噬菌体和Lambda噬菌体相比，生命周期较短。后代噬菌体的​​组装在细菌细胞质中并通过细胞包络裂解释放，因此没有由分泌过程产生的尺寸限制和宿主毒性。此外，T7噬菌体在极端条件下非常稳定，其中其他噬菌体无法生存。gydF4y2Ba

4. 问:我可以使用M13噬菌体展示系统构建cDNA文库吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba通常，M13不适用于cDNA表达，因为M13噬菌体展示需要先导序列（分泌所需）和外壳蛋白pIII或pVIII的N端之间的框架内表达。为了使相应的蛋白质与外壳蛋白正确融合，插入物必须位于两端正确的阅读框中，并且不包含框内终止密码子。这导致M13 cDNA文库中的生产性克隆数量非常少。gydF4y2Ba

5. 问：PIII和PVIII显示的差异是什么？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba次要外壳蛋白pIII和主要外壳蛋白pVIII被证明是最有效的蛋白质和多肽展示。gydF4y2Ba

   与pVIII相比，pIII可以结合并呈现更大的插入物，在大多数ORF和蛋白质展示的情况下，它是首选的支架。噬菌体病毒粒子上有5份pIII蛋白质。短肽和大蛋白都可以与pIII融合。融合蛋白将以低价存在，1-5份，因此对sele有益cting高亲和力粘合剂。gydF4y2Ba

   pVIII(由基因VIII编码)是病毒的主要结构蛋白。大约需要2800个pVIII拷贝来覆盖一个全长野生型病毒粒子。因此，pVIII具有高拷贝数和多价显示。多价显示通过极大地增加亲和性(有效亲和力)，使弱配体和强配体无法区分，从而减少了对这种性质的选择。另一方面，多价在其他应用中可能是一个明显的优势。这就是当我们希望积累广谱的肽作为潜在先导物时的情况;通过单价显示，可以根据亲和度和选择性对所鉴定的多肽进行排序。在pVIII显示系统中，显示的肽的长度有一个明显的限制。pVIII显示系统只能容纳非常短的肽段，大约100个氨基酸，特别是在高DNA拷贝数系统中。pVIII展示系统能够展示300-500拷贝的pVIII融合肽/蛋白。gydF4y2Ba

   vwinCreative Biolabs是pIII和pVIII显示系统的专家，我们将与您紧密合作，为您的项目选择最优的系统。gydF4y2Ba

6. 问:我是否需要进口噬菌体许可证?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba不，噬菌体被认为对人类、动物或植物没有致病性。gydF4y2Ba

7. 问：什么媒体可以用来培养噬菌体？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2BaTSB/TSA（胰蛋白酶大豆肉汤/胰蛋白酶大豆琼脂）可用于培养大多数噬菌体。然而，由于噬菌体展示系统的不同，合适的培养基可以是多种多样的。gydF4y2Ba

8. 问：外壳蛋白pIII的分子量是多少？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba未加工的pIII(具有前导序列，但未显示蛋白或多肽)分子量为44,651 Da;成熟的pIII(不含前导序列)为42,579 Da。然而，通过SDS-PAGE, pIII通常显示60-65 kDa的表观分子量，这是由于蛋白质结构域之间不寻常的富含甘氨酸的间隔区。gydF4y2Ba

9. Q: M13KE是否可以显示外壳蛋白pIII n端抗体片段或蛋白质?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2BaM13KE不受抗体或蛋白表达的影响，因为在这个系统中，pIII的每个拷贝都显示编码的肽序列。任何干扰噬菌体粒子组装或pIII功能的插入物都不会产生活噬菌体。我们认为25-50个氨基酸是这个系统的最大范围。gydF4y2Ba

10. 问:什么类型的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba噬菌体M13能感染菌株吗?它有机会污染我们实验室里的所有细胞株吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2BaM13噬菌体是一种丝状噬菌体，以细菌F接合毛的顶端为受体，促进感染过程。因此，它们只针对gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba含F质粒(FgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)．对于您实验室的菌株，我们建议您检查是否含有F质粒。如果没有，M13噬菌体就不能感染它们。gydF4y2Ba

11. 问:用于构建自定义库的噬菌体载体可用吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba用于构建所有噬菌体展示库的载体可供出售，仅供研究使用。但是，载体的完整序列是私有的，我们只能为您提供示意图、引物和限制性内切酶信息，用于PCR和DNA测序。gydF4y2Ba

12. 问:是否有耐药性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba一号主机应变?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaTG1菌株不含抗生素耐药性，而噬菌体感染的TG1菌株可以通过2YT-AK培养基进行筛选。gydF4y2Ba

13. 问:蓝白筛选能滴定辅助噬菌体吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2BaCreative Biolabs提供的辅助噬菌体不含Lacvwinzα，但携带KangydF4y2Ba^RgydF4y2Ba用于抗生素选择的基因，因此不能通过蓝白筛选来区分。gydF4y2Ba

14. 问:pfu和cfu的区别是什么?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Bapfu是菌斑形成单位，是单个感染颗粒数量的度量单位，通常用于计数噬菌体。gydF4y2Ba

    cfu是指菌落形成单位，是活细胞的量度，其中菌落代表来自单个祖细胞的细胞集合，通常用于计数细菌（例如。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

15. Q：绑定/筛选测试后提供了多少克隆？这些克隆测序了吗？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba在克隆验证阶段，通常会测试40-300个克隆(根据要求可以验证更多克隆)。通过噬菌体酶联免疫吸附试验、DNA测序和可溶性蛋白酶联免疫吸附试验验证其活性。还可以根据要求执行其他验证测试。通常可以发现> 3-10个独特的克隆。我们的客户可以是这些已确认克隆的唯一所有者。gydF4y2Ba

    在这个时候，我们很自豪地提供一个先进的高通量抗体发现平台，徳赢gydF4y2Ba魔术™ 治疗性抗体发现平台（MTADP）徳赢gydF4y2Ba．经过文库筛选后，MADTP可以识别富集文库中所有具有VH-VL配对信息的独特抗体序列(~10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)．而使用ELISA，只有很小的一部分，40-300个克隆，将被分析。如果我们想获得好的治疗性/诊断性抗体，拥有大量的候选抗体是非常重要的。因此，高度推荐使用MTADP，因为从大量候选抗体中识别功能性抗体的机会要大得多。gydF4y2Ba

16. 问:能否要求上清液或少量纯化抗体用于内部检测?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba筛选完成后，将对一些随机克隆进行验证。阳性克隆的上清可作为额外的交付品提供给客户。我们还可根据客户要求提供纯化单链抗体/Fab抗体/IgG抗体的生产服务。gydF4y2Ba

17. 问：是否有抗M13抗体？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba是的，我们可以提供抗m13抗体。我们可以提供重组抗m13主要外壳蛋白抗体(cbbb - 0206mc)或其他定制的抗m13抗体的选择。详情请联系我们的客户服务。gydF4y2Ba

18. 问:大量的项目有折扣吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba是的，我们可以为大量项目提供批量折扣。有关更多详细信息，请联系我们的客户服务。gydF4y2Ba

平移和筛选相关问题gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问:可以提供哪些筛查方法?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba可以提供许多不同类型的筛选方法，例如使用溶液中的抗原进行筛选、使用固定化抗原进行筛选、在整个细胞上进行筛选，以及gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba筛选。项目的成功通常取决于用于筛选的方法。我们将与您合作，以确定项目的最佳筛选方法。gydF4y2Ba

2. 问：筛查的步骤是什么？如果一切顺利，我们什么时候能得到抗体？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba通常，对于文库筛选步骤，我们需要进行3到4轮的生物筛选，以获得良好的和特异性的目标蛋白富集。对于naïve图书馆来说，在前两轮甚至三轮选择之后，充实通常不会被观察到;在第四轮谈判中，通常可以找到浓缩。然而，对于那些已经存在的配体，富集可能会很快被观察到。gydF4y2Ba

   在每种筛选结束时，将进行单克隆噬菌体ELISA和粘合剂噬菌体验证：将验证一系列单独的克隆以选择阳性结合克隆。然后将对阳性克隆进行DNA测序并鉴定独特抗体粘合剂的最终DNA序列。之后，所选择的抗体片段可以表示为无噬菌体的形式，以通过QC可溶性ELISA进一步测试它们的结合特异性。gydF4y2Ba

   通常，完成整个筛选项目需要大约3个月的时间，这可能因项目的复杂性而异。当客户取得微小成就或需要做出决定时，如完成生物筛选、克隆验证结果，将向您发送进度报告。gydF4y2Ba

3. 问：哪些基因元件可用于筛选展示的噬菌体和环境噬菌体？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba显示矢量包含放大器gydF4y2Ba^RgydF4y2Ba．请使用2YT-G培养基培养噬菌体感染的细胞。此外，M13KO7辅助噬菌体含有KangydF4y2Ba^RgydF4y2Ba，这是噬菌体包装所必需的。加入辅助噬菌体后，可以使用2YT-AK培养基选择所需的噬菌体。gydF4y2Ba

4. 问:你建议用哪种盘子来进行淘洗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba对于固相筛选，几乎所有的商用聚苯乙烯板都能完成这项任务。而如果基于板的溶液筛选是首选，链霉亲和素涂层板是必需的。使用链霉亲和素涂层珠是溶液内筛选的另一种选择。gydF4y2Ba

5. 问：每轮筛查应该使用多少个噬菌体？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba噬菌体颗粒的数量应约为文库大小的100倍(如10gydF4y2Ba^12.gydF4y2Ba10人图书馆的pfugydF4y2Ba^10.gydF4y2Ba克隆）。通常，100μl文库（10gydF4y2Ba^12.gydF4y2BaPFU / ml）每孔用于一个平移。可以调整此卷以进行不同的平移策略。Creative Biolabs提供的噬菌体文库的滴度是〜10vwingydF4y2Ba^13.gydF4y2Ba空斑形成单位/毫升。准备10gydF4y2Ba^12.gydF4y2Bapfu/mL，将50 μL的文库用200 μL PBS稀释，然后与250 μL的4% PBSM(含4%牛奶的PBS)混合。gydF4y2Ba

6. 问：每一轮的丰富因素是什么？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba关于富集因子，它表示从目标涂层井洗脱的克隆与输入的比率。富集因子越低，富集效果越好。通过监测富集因子，可以跟踪选择过程的进展。对于幼稚的图书馆来说，在前两轮选择中通常没有观察到丰富的内容；而在第三轮或第四轮筛选后，预计富集系数比前几轮筛选低5-10倍，表明富集良好。对于免疫文库或基于预先存在的配体的文库，可以更快地观察到富集。gydF4y2Ba

7. 问：在每一轮淘洗之后，如何正确计算噬菌体滴度？辅助噬菌体会影响计数的准确性吗？每次平移应添加多少辅助噬菌体？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba输入或输出噬菌体的pfu可通过用连续稀释液（10）感染TG1细胞滴定噬菌体来计算gydF4y2Ba^-6gydF4y2Ba, 10gydF4y2Ba^-8gydF4y2Ba, 10gydF4y2Ba^{－10gydF4y2Ba}, 10gydF4y2Ba^{-12年gydF4y2Ba})噬菌体储备、电镀至2YT-AG、孵育和计数Amp的数量gydF4y2Ba^RgydF4y2Ba出现的殖民地。计算PFU / mL的噬菌体滴度。重组噬菌体含有放大器gydF4y2Ba^RgydF4y2Ba基因，但辅助噬菌体没有并且不能在2YT-AG板上生长。gydF4y2Ba

8. 问：每个平移应该增加多少辅助噬菌体？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba每次平移，将辅助噬菌体添加到最终浓度为5×10gydF4y2Ba^9gydF4y2BaPFU / ml用于噬菌体包装。gydF4y2Ba

9. 问:我是否需要在每一步淘洗前在M9培养基中培养TG1 ?这对我的实验是必要的吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba我们试剂盒中提供的TG1来自M9最小琼脂平板上培养的菌落。这是为了确保F菌毛的表达，因为这是噬菌体感染所必需的。在每一个淘洗步骤之前，不需要在M9最小板上再次培养它们。gydF4y2Ba

10. 问:你认为对于成功的淘选，在预先制作的噬菌体库的协议中还有其他没有明确规定的细节吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba以下是关于平移协议应该注意的几点。gydF4y2Ba

    1） 随着时间的推移，噬菌体表面Fab和scFv的稳定性降低。使用新制备的噬菌体抗体进行淘洗，以最大限度地增加淘洗过程中结合的噬菌体数量：这适用于库噬菌体和淘洗过程中扩增的噬菌体的使用。gydF4y2Ba

    2)简单改变标准的淘洗方案，如改变缓冲液的成分、洗涤条件和Ag浓度，可以降低非特异性噬菌体结合水平和/或特异性噬菌体抗体结合程度。gydF4y2Ba

    3） 在淘洗前，应使用适当的ELISA确定每个Ag的最佳包衣浓度（包衣缓冲液、浓度和温度）。所述摇摄方案建议在所有摇摄过程中使用单一最佳涂层浓度（取决于所使用的银）。并非所有平移方法都保持单一浓度。摇摄过程的数学模型表明，银的浓度会影响Abs的选择。例如，高浓度的银增加了富集库中低频率存在的低亲和力Abs或Abs的可能性。考虑到这一点，使用高、低或不同浓度Ag的平移策略可用于分离在库中特定频率或具有特定亲和力的Abs。gydF4y2Ba

预制噬菌体库相关问题gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问：当我收到Premade Phage Library时，我该怎么办？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba首先培养供给的细菌。你可以将噬菌体保持在4°C下几天。如果需要长期储存，请将试剂盒移至-80°C。gydF4y2Ba

2. 问：我应该将噬菌体库储存在-20°C还是4°C？在不降低复杂性的情况下，它可以存储多长时间？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba噬菌体颗粒可在4°C下以感染状态保存1个月或-80°C下保存1年。它们在-20°C比在-80°C更不稳定。因此，为了长期存储，您可以将试剂盒移动到-80°C。gydF4y2Ba

3. 问:你们制作的噬菌体库包提供哪些类型的库?辅助噬菌体的用途是什么?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba该试剂盒提供了两种形式的文库，一种是在噬菌体颗粒中，另一种是在噬菌体(RF DNA)中。所提供的噬菌体颗粒为重组的全感染性噬菌体颗粒，可直接用于筛选。RF DNA仅用于该文库的测序验证。每轮筛选后，辅助噬菌体可用于扩增输出噬菌体。gydF4y2Ba

   对于所提供的预制文库，抗体使用基于质粒的“噬菌体”辅助噬菌体系统进行展示。噬菌体感染宿主细胞后，在没有辅助噬菌体感染的情况下，只能以质粒的形式在宿主细胞内复制，不能被包装成噬菌体颗粒或重组噬菌体。辅助噬菌体为噬菌体形态发生所需的结构、包装和组装蛋白的生产提供基因。因为辅助噬菌体在复制或包装序列的起点携带突变，所以在复制过程中，噬菌体基因组的包装比辅助噬菌体基因组更有效。Phagemids转换gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba宿主与辅助噬菌体共同感染，形成具有完全感染性的噬菌体颗粒。gydF4y2Ba

4. 问:噬菌体库试剂盒可用于10个生物筛选项目，我们是否需要在筛选前进行筛选?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba是的。该工具包可用于10个独立的生物制片。对于每次平移，我们建议增加10个gydF4y2Ba^12.gydF4y2Ba用于第一轮筛选的pfu噬菌体颗粒（100µL噬菌体制剂）。因为我们提供了1毫升（~1.0×10gydF4y2Ba^13.gydF4y2Bapfu/mL）的噬菌体制剂，您可以将其等分，并在-80°C下长期储存。gydF4y2Ba

5. 问:可从人抗体库中分离单克隆抗体的预制库有哪些?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba我们有以下人类抗体库，它们具有很大的多样性，能够获得亲和力范围从10μm到10μm的高亲和力抗体。gydF4y2Ba

   •gydF4y2Ba	HuScL-2:人单链抗体库gydF4y2Ba
   •gydF4y2Ba	HuFabL-1:人Fab抗体库gydF4y2Ba
   •gydF4y2Ba	Huscl-3：人单链抗体库gydF4y2Ba
   •gydF4y2Ba	HuFabL-2:噬菌体展示人源Naïve和半合成Fab噬菌体展示库gydF4y2Ba
   •gydF4y2Ba	Huscl-5：人类合成SCFV库gydF4y2Ba
   •gydF4y2Ba	HuScL-4:湖南Naïve scFv图书馆gydF4y2Ba

   
   

6. 问:在你们预先制作的噬菌体展示库中，scFvs或fab是否来自相同的克隆表达，只是翻译后消化亚型?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba我们有各种SCV和FAB库，包括天真，半合成和完全合成的库。他们来自不同的来源。gydF4y2Ba

7. 问:定制抗体的典型亲和力是什么?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba为了筛选制备前/免疫噬菌体展示抗体库，我们可以识别nM到pM范围内的抗体。此外，我们提供高质量的亲和力成熟服务，我们能够将抗体亲和力从1.0 nM-20 nM增加到10 pM-100 pM。gydF4y2Ba

8. 问:图书馆可以用来筛选整个细胞吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba是的。vwinCreative Biolabs在细胞库筛选方面有丰富的经验。细胞筛选程序已经建立，可以直接在完整的细胞上选择噬菌体显示的抗体库。对于许多细胞表面抗原，其生理构象只能维持在整个细胞的形式，这些抗原在治疗或成像方面具有很大的吸引力。部分细胞表面蛋白无法表达和纯化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．这种策略克服了获得重组抗原的障碍。此外，它还可用于筛选针对疾病相关过表达或修饰产生的新表位的抗体。gydF4y2Ba

9. 问：您的预制库可以用于gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba筛选吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba对我们的预制肽库已用于选择器官特异性肽gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba成功。gydF4y2Ba

10. 问:是否有可能重新扩增细菌库，并为未来的实验获得额外的细菌库副本?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba建议不要重新扩增噬菌体库，因为再扩增会明显降低原噬菌体库的多样性。gydF4y2Ba

11. 问:关于可溶性抗体表达，在你们的手册中，HB2151用于质周可溶性表达。您使用HB2151有什么特别的原因吗?你曾经用过其他主机吗?可以用SS320代替HB2151吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba抗体和GIII基因之间有一个琥珀色止芯标签。因此，对于抗体可溶性表达，我们需要使用非抑制细菌菌株，其中可以识别琥珀色止芯密码子，并且抗体可以以可溶性的piii形式表达并分泌到周质中。HB2151和TOP10是最常用的。由于SS320也是非抑制剂菌株，其通过将F'eBisome从Xli-Blue（Stratagene）转移到MC1061（Bio-rad）构成，因此能够用于抗体周质可溶性表达。gydF4y2Ba

12. 问：我应该在37°C或30°C的噬菌体中培养噬菌体，以便与您的Premade Library Kit一起使用吗？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba通常，噬菌体的最佳生长温度取决于宿主细菌的生长温度。对于我们每个预先制作的噬菌体库，建议的生长温度在手册中有说明。gydF4y2Ba

13. 问:对于“噬菌体文库作为质粒”的文库试剂盒组分，是否提供转化产生文库的工具?然而，没有任何协议用于此目的。我们怎么做呢?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba文库质粒仅用于对该文库进行测序验证（通过对这些质粒测序，应了解文库的多样性），而不用于再次产生Fab文库的转化。此外，试剂盒中包含的质粒数量不足以构建文库。因此，我们没有在手册中提供库质粒转化的协议。gydF4y2Ba

14. 问：我们正试图集中我们获得的噬菌体库。我们能用我们获得的文库直接感染TG1细胞吗？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba如果您想增加噬菌体颗粒的浓度，我们建议您直接用噬菌体沉淀剂（PEG/NaCl:20%（w/v）聚乙二醇-8000，2.5 M NaCl）沉淀噬菌体文库，并用少量PBS重新悬浮颗粒。不要通过感染TG1细胞来扩增文库，因为扩增会显著降低原始噬菌体文库的多样性。gydF4y2Ba

15. 问:我在pCDisplay 4中表达和纯化抗体片段时，是否可以使用抗组氨酸抗体而不是抗ha抗体来检测蛋白?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba是的。在pCDisplay-4中有两个标签，一个是6x His，另一个是HA。这两种标签都可以用于抗体的纯化和检测。gydF4y2Ba

16. 问：您是否可以向我们提供与库插入一起使用的噬菌动物的详细矢量地图（序列）？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba这个载体的全序列是私有的，我们只能提供原理图、引物和限制性内切酶信息给你进行PCR和DNA测序。gydF4y2Ba

17. 问:你能提供pCDisplay-5矢量的放大器尺寸给我们吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2BapCDisplay-5矢量的大小为4.8 kbp。L1和S6引物可用于菌落PCR和噬菌体DNA测序，L1为正向引物，S6为反向引物。PCR产物大小为660 bp。gydF4y2Ba

18. 问:既然噬菌体是在75%乙醇中提供的，你是否建议分离质粒并重新悬浮在水中进行PCR?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba为了保护质粒不被降解，我们将质粒放入75%乙醇中。在PCR之前，你可以通过在20000℃下离心试管来沉淀质粒gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃静置5min, DNA成球，弃上清，真空静置5min。由于质粒的数量只有10µg，离心后看不到任何颗粒是很正常的。建议直接加水(10-20 μL)，用移液管尖上下反复多次使DNA重新悬浮。gydF4y2Ba

19. 问:pCDisplay-3M噬菌体载体是否适用于选择克隆的sdAb的直接周质表达(琥珀终止密码子或类似策略)，如果适用，存在什么标签?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba是的。pCDisplay-3M可用于sdAb的周质直接表达。在sdAb和gIII基因之间有一个琥珀色终止密码子TAG。对于sdAb的可溶性表达，我们需要使用非抑制菌株，如HB2151或TOP10，在这些菌株中，琥珀终止密码子可以被识别，sdAb可以以可溶性的pIII-free形式表达并分泌到质周。此外，6×His标签将涉及到sdAb的c端。gydF4y2Ba

抗原相关问题gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问:我需要携带什么抗原?我需要把抗原放在干冰上吗?你现在是如何储存蛋白质的?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba请提供订购单以及抗原和缓冲液成分的浓度。纸质文件最好装在自封袋中。如果储存环境为-80°C，则只需要使用干冰。如果蛋白质是稳定的，冰袋就可以了。请按标准隔夜发货gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba联邦快递或类似的快递公司。gydF4y2Ba

2. 问：在我把重组蛋白发送给你之前，我需要把标签从重组蛋白上切掉吗？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba较大的标签（GST、MBP等）应被切割，因为它们会干扰特异性抗体的产生。小标签，如His、Myc和FLAG，在抗体产生之前不需要切割。gydF4y2Ba

3. 问:什么因素会影响抗原?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba
   抗原类型:gydF4y2Ba

   方法的选择将取决于目标属性(特异性表位、交叉反应性、保守程度等)、抗体的最终使用情况和其他特异性抗原信息。请联系我们讨论您的特定抗体目标，以便我们可以建议最好的方法。gydF4y2Ba

   抗原大小:gydF4y2Ba

   半抗原和肽需要与载体蛋白偶联才能产生免疫原性。大于10kDa的抗原被认为具有免疫原性。gydF4y2Ba

   抗原纯度:gydF4y2Ba

   免疫抗原应为可用的最高纯度。建议纯度大于90%。gydF4y2Ba

   
   

4. 问:我的肽应该是多长?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba建议12-25个氨基酸长度为最佳肽段长度。因为10-12个氨基酸的长度是基于B细胞表位的标准尺寸。这个长度要求的例外情况发生在针对磷酸化位点或其他修饰位点的抗体。单个残基的磷酸化会在表位中产生微小的构象变化。选择8-12个位于中心位置修饰的氨基酸多肽，以提高磷特异性抗体的产生。gydF4y2Ba

5. 问:我的抗原应以何种形式进行免疫和筛查?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba对于免疫，如果抗原是可溶的，我们倾向于在无菌中性缓冲液中(不含添加剂)最低浓度为1 mg/mL。请确保您的样品不含任何有害/有毒物质，例如:尿素、福尔马林、叠氮化钠、甘油、极端pH值、高盐或高浓度咪唑。如果您不确定，请与我们联系以获取详细信息。如果抗原是冻干的，请提供重组方案。gydF4y2Ba

   对于使用解决方案排序筛选策略，缓冲区应避免含有伯胺（例如TRIS）。gydF4y2Ba

6. 我的抗原是一种融合蛋白。这是一个问题吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba添加融合蛋白是为了易于纯化或提高靶蛋白的免疫原性，但很有可能会产生针对大标签（GST、MBP等）的抗体。请把较大的标签劈开。小标签，如His、Myc和FLAG，在抗体产生之前不需要切割。gydF4y2Ba

7. 问:载体蛋白偶联通常使用什么化学方法?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2BaKLH是一种直接、高效和稳定的化学物质，不会影响合成抗体的特异性。我们建议在缩氨酸的末端加入半胱氨酸(或设计缩氨酸时使用天然的半胱氨酸)，并使用游离巯基与KLH结合。也有几种替代的偶联方法，但仅推荐在抗原中有内部或多个半胱氨酸的情况下。gydF4y2Ba

8. 问:我已经合成了我的肽;我可以发给你做抗体吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba是的，Crvwineative Biolabs是公认的抗体生产专家之一。请提供至少10 mg用于KLH接合的冻干肽，并与我们联系以获取报价。gydF4y2Ba

9. 问：一个定制项目需要多少抗原？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba免疫原的数量取决于各种因素，如使用的动物类型和数量，以及筛选策略。一般的指导方针是小动物至少2.5毫克，大动物至少5毫克。值得注意的是，如果你目前没有足够的抗原，你总是可以给我们发送你所拥有的来启动这个项目，稍后再发给我们更多。请根据您的具体项目与我们联系以获得更详细的说明。gydF4y2Ba

10. 问：我们应该提供的抗原纯度是多少？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba在最一般的术语中，肽抗原和蛋白质抗原需要约90％纯度或更高。具有高纯度的免疫原将在宿主中诱导精确的免疫应答。杂质有机会是免疫原性的，因此产生非特异性抗体。请注意，抗原的要求可能不同于不同的项目。如果您含有较低纯度的抗原，请随时与我们联系，我们仍然可以获得具有自定义战略的高质量抗体。gydF4y2Ba

11. Q：定制项目应该使用哪种类型的抗原？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba我们可以使用各种类型的抗体进行抗体发育，包括但不限于重组蛋白，抗体，肽，全细胞，DNA和耐抗原。我们将与您合作，确定您的项目最合适的抗原形式。gydF4y2Ba

    脱氧核糖核酸：gydF4y2Ba对于难以表达的抗原，DNA免疫将是一个好的选择。随着目标序列的信息，我们将能够构建编码目标的质粒并使用它以免疫。gydF4y2Ba

    蛋白质/肽:gydF4y2Ba蛋白质和肽是最常用的免疫原。如果您的肽未与载体蛋白缀合，我们还提供肽共轭服务。gydF4y2Ba

    整个细胞:gydF4y2Ba过表达目的蛋白的细胞系可作为免疫原。还需要一个不表达目标蛋白的对照细胞系。特别适合于发现针对膜蛋白(细胞外结构域)和肿瘤细胞系生物标志物的新型抗体。徳赢gydF4y2Ba

    半抗原:gydF4y2Ba由于半抗原体积小、结构简单，可能需要与载体分子偶联以提高免疫原性。我们能够将半抗原与合适的载体蛋白(包括锁孔帽状血色素蛋白(KLH)、卵清蛋白和牛血清白蛋白(BSA))结合，显著提高免疫应答。gydF4y2Ba

12. 问：抗原的最小尺寸是什么可以诱导免疫反应？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba能产生免疫反应的最小抗原大小取决于蛋白质的固有特性。我们已经成功地使用了一种4kda蛋白进行免疫。gydF4y2Ba

13. 问：我们是否为筛查提供抗原/靶蛋白？如果是，需要多少蛋白质？gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba如果你没有目标蛋白，我们有抗原表达服务，可以提供高质量的抗原。如果你有这种蛋白质，1.5毫克就足以进行常规筛选和克隆验证实验。gydF4y2Ba

免疫相关问题gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问:Creative bvwiniolab如何治疗他们的免疫系统?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Bavwin创新生物实验室遵循国际实验动物护理评估与认可协会(AAALAC)发布的抗体生产指南。vwin创造性生物实验室与OLAW合作，确保动物实验机构。在创新生物实验室，所有的免疫者vwin都受到尊重，并有完善的程序，以确保免疫者能够学习和玩耍。提供玩具、零食和筑巢材料。如果可以的话，他们也会每天接受人类的接触和情感。gydF4y2Ba

2. 问：你如何测试免疫效果？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba免疫前和免疫后收集的血清将使用ELISA检测对免疫原的反应性。将免疫原包被在ELISA板上，然后连续稀释含有抗体的抗血清。我们也可以为客户的内部化验提供抗血清。gydF4y2Ba

3. 问:你会在免疫期间检测出血吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba是的，我们在免疫接种之前和第3或第3次注射后进行测试。免疫血清将通过间接ELISA滴定，以评估免疫应答。在终止动物之前，血清也可以向客户的特异性测定中运送到客户端。gydF4y2Ba

4. 问:良好免疫的预期效价是多少?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba我们预计滴度为> 10000。滴度越高，获得高亲和力抗体的机会越大。我们曾经发现过效价为6000的优秀抗体。gydF4y2Ba

5. 问：免疫前血清有什么作用？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba免疫前血清是一种很好的阴性对照，适用于各种各样的实验。gydF4y2Ba

6. 问:接种疫苗需要多长时间?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba通常，免疫接种需要2-3个月。确切的时间表取决于宿主产生的免疫反应的强度。额外的刺激措施可能会延长这一计划。gydF4y2Ba

7. 问:兔单克隆抗体是否优于小鼠单克隆抗体?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba兔单克隆抗体的典型亲和力比小鼠抗体高10-100倍。在以下情况下，强烈推荐使用兔单克隆抗体：1）需要在IHC或WB中表现优异；2） 检测低表达水平的靶点；3） 用其他小鼠单克隆抗体进行ELISA分析。gydF4y2Ba

8. 问：为什么我需要两只兔子？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba每种动物对免疫的反应都不同，而且通常对单个抗原产生不同的抗体亚群。免疫两种免疫增加了其中一种免疫提供对感兴趣蛋白质具有高反应性和特异性的抗体的几率。gydF4y2Ba

9. 问:我应该用什么品种的老鼠?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba大多数客户选择使用BALB/c鼠标。瑞士韦伯斯特和A/J小鼠也经常可用。gydF4y2Ba

10. 问:什么物种被用来制造抗体?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Bavwin创意生物实验室可以使用所有流行的抗体生产物种来制造单克隆抗体，包括人类、兔子、鸡、美洲驼、骆驼、羊驼、牛、狗、老鼠、大鼠、绵羊、猴子，最近还有鲨鱼。gydF4y2Ba

11. 问:什么种类的抗体可以人化?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba我们已经将许多物种的抗体人性化了，比如老鼠、兔子、鸡、狗和美洲驼。gydF4y2Ba

12. 问:我应该选择什么种类的抗体生产?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba

    动物gydF4y2Ba	属性gydF4y2Ba
    鼠标gydF4y2Ba	优势gydF4y2Ba 1.降低饲养成本gydF4y2Ba 2.易于维护和操作gydF4y2Ba 3.繁殖能力强gydF4y2Ba 4.诱导对多种抗原产生良好的免疫反应gydF4y2Ba 缺点gydF4y2Ba 少量血清gydF4y2Ba
    老鼠gydF4y2Ba	优势gydF4y2Ba 1.多种抗体亚型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体亚型gydF4y2Ba 2.诱导对小鼠抗原的免疫反应gydF4y2Ba 3.减少抗原的要求gydF4y2Ba 4.小鼠背景抗原免疫检测中无交叉反应gydF4y2Ba 缺点gydF4y2Ba 少量血清gydF4y2Ba
    兔子gydF4y2Ba	优势gydF4y2Ba 1.能够识别啮齿动物单克隆抗体看不见的啮齿动物和人类抗原之间保守的表位gydF4y2Ba 2.降低饲养成本gydF4y2Ba 3.易于维护和操作gydF4y2Ba 缺点gydF4y2Ba 中量血清gydF4y2Ba
    鸡gydF4y2Ba	优势gydF4y2Ba 1.高亲和性:由于系统发育距离，大多数哺乳动物蛋白在鸡体内比在哺乳动物体内表现出更高的免疫原性，从而提高抗体的亲和性。gydF4y2Ba 2.特异性高:与哺乳动物IgG相比，鸡IgY与哺乳动物IgG以外的蛋白的交叉反应性较低。gydF4y2Ba 3.较低的背景：IgY和IgG在FC区结构不同;IgY与IgG Fc受体没有结合，并导致较少的假阳性染色。gydF4y2Ba 4.高产量：需要极少量的抗原才能在蛋黄中获得高且持久的IgY滴度；鸡定期产蛋，提供持续的IgY抗体来源。gydF4y2Ba 缺点gydF4y2Ba 几个抗体同形像gydF4y2Ba
    山羊gydF4y2Ba	优势gydF4y2Ba 1.远离人类和啮齿动物gydF4y2Ba 2.抗血清量大，是小动物个体的7-8倍gydF4y2Ba 3.适合大规模生产gydF4y2Ba 4.高稳定性gydF4y2Ba 缺点gydF4y2Ba 1.高成本gydF4y2Ba 2.免疫周期长gydF4y2Ba
    豚鼠gydF4y2Ba	优势gydF4y2Ba 1.更敏感gydF4y2Ba 2.产生对具有人，小鼠和大鼠同源性高同源性的抗原的更强的抗体反应gydF4y2Ba 3.针对特定目标提供新颖的解决方案gydF4y2Ba 缺点gydF4y2Ba 1.高成本gydF4y2Ba 2.免疫周期长gydF4y2Ba
    骆驼gydF4y2Ba	优势gydF4y2Ba 1.只产生具有重链的新型抗体gydF4y2Ba 2.增加了免疫库的功能大小gydF4y2Ba 3.高物理化学稳定性gydF4y2Ba 4.多价格式的简易生产gydF4y2Ba 5.快速组织渗透，快速清除gydF4y2Ba 6.也表达了gydF4y2Ba 缺点gydF4y2Ba 1.相对较长的免疫周期gydF4y2Ba 2.由于抗体的单一结构域性质，它可能是小抗原，例如Hapten的缺点gydF4y2Ba

噬菌体衍生抗体相关问题gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问：抗体可以转化为IgG吗？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2BavwinCreative Biolabs可以毫不费力地将Fab/scFv转化为全尺寸IgG。此外，我们在哺乳动物细胞中提供重组IgG生产。gydF4y2Ba

2. 问:我如何储存我的抗血清/抗体?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba血清可在-20°C下储存一年，或在4°C下储存不到一个月。对于长期储存，添加0.05%叠氮化物并冷冻。纯化抗体在-80°C下储存时最稳定，应避免多次冻融。或者，您可以添加总浓度为30-50%的甘油，并将抗体储存在-20°C下。gydF4y2Ba

3. 问:如何利用噬菌体克隆生产抗体?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba用于噬菌体展示的载体（启动子较弱）不适合直接表达抗体。解决方案是将抗体盒克隆到另一个具有强启动子的表达载体中，如T7。gydF4y2Ba

   请确保在扩增抗体序列时去除基因III序列，基因III用于噬菌体展示。gydF4y2Ba

4. 问：你能生成DNA特异性抗体吗？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba是的，抗体可以针对特定的预先确定的DNA序列。我们先进的筛选策略旨在区分目标核苷酸序列和非特异性序列。gydF4y2Ba

5. 问：抗体噬菌体展示筛查后，如果我们获得许多高亲和力克隆，那么这些克隆属于我们吗？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba我们可以使用按服务付费模式，因此所有选定的克隆都属于我们的客户。gydF4y2Ba

6. 问:在你的经验中，人类scFvs/ fab对人类免疫系统具有免疫原性吗?免疫原性对我们来说可能是个问题。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba人单链抗体/Fab可能具有免疫原性。然而，与其他物种的抗体相比，完全人源抗体的免疫原性最低。gydF4y2Ba

7. 问：亲和力为SCFV / FAB的好粘合剂有多高？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba我们之前已经鉴定了10pm - 10nm亲和力的抗体。有大量声誉良好的参考文献使用了我们的服务，并获得了良好的人体抗体用于治疗。gydF4y2Ba

8. 问：用于生产SCFV的更好的表达系统，用于大规模生产？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba是目前最常用的单链抗体表达系统，具有高效、低成本、高产等优点。因此，在大多数情况下，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba将有利于大规模表达。gydF4y2Ba

9. 问:可以gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达的单链抗体在应用于动物时（如在动物的循环系统中），仍然保持抗体功能，不会变性或错误折叠？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba哺乳动物表达系统的一个优点是内毒素水平低，这对免疫功能非常重要gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba应用程序。由于你将在动物中使用单链抗体，当单链抗体的溶解度不成问题时，哺乳动物细胞表达可能是最好的选择。一些scFvs具有低溶解度，然后gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba系统可将其表达为包涵体并去除内毒素gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba应用程序。gydF4y2Ba

噬菌体展示抗体库构建的相关问题gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问：人类天真图书馆建设的RNA样品的数量和质量要求是多少？要实现高滴度库，那是什么最佳条件？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba>优选500μg具有高纯度的总RNA。为了构建高度多样化的抗体库，重要的是使起始材料从足够数量的人样品中进行。例如，来自100人的2-5毫升血液或50人的5-10毫升血液。对于良好的Naïve库，至少需要几百毫升或1-2升血液来确保多样性。gydF4y2Ba

2. 问：你怎么知道建造的图书馆是完美的？gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba从免疫库中选择的抗体的亲和力与库的大小成正比，库库库库越大，抗体亲和力越好。通常，最终图书馆的规模应该达到108个。它足够大，可以分离高亲和力抗体。此外，作为一个完善的图书馆，它应该具有高度的多样性。最终文库的QC结果显示，所有随机选取的无性系均未发现共同序列，说明文库的多样性处于较高水平。gydF4y2Ba

3. 问:关于用于建库的RNA样本，您能提供从脾脏细胞中提取RNA、储存和运输的方案吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba关于RNA纯化，由于RNA非常容易被降解，RNA样本的质量对噬菌体库的构建非常重要，如果你没有进行RNA纯化实验或处理RNA样本的经验，我们建议您用Trizol™试剂准备组织样本，然后直接寄给我们。我们将为您提供专业的RNA分离服务。gydF4y2Ba

4. Q：Trizol的替代品™, 是否有可能以RNA形式发送免疫动物的样本（脾细胞和PBMC）gydF4y2Ba晚些时候gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba你的吗?gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba作为替代，您也可以使用RNAgydF4y2Ba晚些时候gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba准备组织或血液样本并将它们发送给我们。然而，应该注意的是，对于整个血液样本，我们建议在添加RNA之前收集外周血单核细胞（PMBC）gydF4y2Ba晚些时候gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba. 不要添加RNAgydF4y2Ba晚些时候gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba直接接触血液。gydF4y2Ba

故障排除gydF4y2Ba[↑顶部]gydF4y2Ba

1. 问:试剂盒中提供的菌株不能生长。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2BaHB2151和TG1的细菌以刺培养的形式提供。这些细菌从未解冻，将在4°C下持续2周。收到试剂盒后，应进行新鲜甘油培养。如果在平板上划线后不能生长，则需要新鲜培养物。可以订购额外的刺培养物以支付运输费用。gydF4y2Ba

2. Q:扩增噬菌体滴度低。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba为了有效扩增M13噬菌体，培养物应充分通气。我们建议在500ml Erlenmeyer烧瓶中扩增100ml培养物，摇床设置为300rpm。在更小的容器中扩增将导致扩增噬菌体的产量大大降低。同时，培养物应该在生长早期就被感染。当A600达到0.8-0.9时加入M13KO7辅助噬菌体。gydF4y2Ba

3. Q:在使用随机多肽噬菌体库进行实验时，酶联免疫吸附试验的平板结合背景过高。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba在移动步骤中，如果目标物直接被涂在聚苯乙烯板上，就有可能选择特定结合聚苯乙烯表面的肽段(见Adey, n.b。gydF4y2Ba等等。gydF4y2Ba（1995）基因156，27-31）。这些肽通常富含芳香残基，并且由于ELISA板也是由聚苯乙烯制成的，因此在没有靶点的情况下将产生高ELISA信号。聚苯乙烯特异性肽的选择通常发生在对文库中存在的肽序列缺乏强烈的靶向偏好的情况下：其他文库可能产生所需的靶向特异性序列。gydF4y2Ba

4. Q:用HuFab库进行5轮或更多的平移后，许多克隆都是假克隆，只有部分CH1域。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba通常为2×10gydF4y2Ba^11.gydF4y2Ba输入噬菌体在一轮生物筛选中添加，在10个之间gydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba和10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba洗涤后总噬菌体被洗掉。图书馆应该充实一下gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba每轮折叠。理论上，既然图书馆的多样性是6×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba，洗脱的噬菌体池应完全富集，以3或4轮后结合抗体。一旦达到了这一点，就会进一步回合扩增和平移仅在选择具有在图书馆噬菌体上具有生长优势的噬菌体的选择。例如，如果进行过多的放大，则消失的小水平将完全超过游泳池。gydF4y2Ba

5. Q：当用肽噬菌体库平移时，最终选择的序列与BSA结合，而方案不针对BSA结合物进行选择。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba最有可能的是，“BSA结合”序列实际上是结合在聚苯乙烯板表面，而不是BSA。牛血清白蛋白是一种可溶性的单体球状蛋白，没有固定的配体结合位点。配体结合位点的缺失正是在噬菌体展示应用中通常使用BSA进行阻断的原因。这意味着蛋白质的整个表面已经进化到专门与水结合(“可溶”的定义)。在淘洗过程中，肽不太可能与牛血清白蛋白表面特异性结合。与之相反的是，目标蛋白有一个确定的配体结合位点，比如抗体。在这种情况下，蛋白质表面已经进化到与水结合，但配体结合位点上的水结合不那么紧密，可以被配体置换。因此，当噬菌体库与抗体结合时，噬菌体库中的特定配体能够置换抗体配体结合位点的水，但不结合抗体表面的其他部位。底线是，对于小肽配体，通常没有足够的潜在结合能来取代蛋白质非配体结合表面的水。gydF4y2Ba

6. 问：与从肽库中鉴定的ELISA阳性序列对应的合成肽不会结合我的目标。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba在淘洗过程中，所选肽序列的N-末端是游离的，然而，C-末端与噬菌体融合，并且没有带负电荷的游离羧酸盐。如果所选序列仅以完整噬菌体而非合成肽的形式与目标结合，则所选序列可能需要来自相邻间隔序列的额外元件进行结合。一个带有游离羧基末端的简单合成肽将在某个位置引入带负电荷的基团，并完全消除结合。因此，我们建议在合成与所选序列对应的肽时，将间隔序列Gly-Ser添加到C端。gydF4y2Ba

7. 问:我做过噬菌体展示选择，在分析克隆时遇到过问题。DNA的产量千差万别，所以测序的材料很差。不同克隆的噬菌体产量差异很大。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba这些问题是噬菌体展示法的主要缺点，它们确实很常见。然而，这些问题可以通过多次重复实验来解决。通常，我们进行2-3次噬菌体ELISA试验，并使用平均OD值进行结果分析。同时，还需要通过可溶性抗体ELISA对这些阳性克隆进行进一步验证。gydF4y2Ba

   对于DNA测序，我们建议您先取阳性克隆，然后在10- 20ml培养基中培养过夜，以获得足够的细菌细胞进行质粒分离。gydF4y2Ba

8. 问:你们是否有噬菌体酶联免疫吸附试验的阳性对照?我的积极控制也有问题不能给噪音一个好的信号。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba目前尚无可用于噬菌体单克隆ELISA的阳性对照。通常，我们选择阳性克隆的标准是：减去背景（无涂层）后，克隆的目标蛋白A450值应大于0.5。此外，目标蛋白的值应为阴性对照值的3倍或更多倍（添加辅助噬菌体而不是单克隆噬菌体）。gydF4y2Ba

9. 问:我们购买了HuFabL-2噬菌体展示库试剂盒。关于可溶性fab的生产，根据用户手册，噬菌体中包含的III基因的3域在转化前需要通过Mlu1酶切和再连接去除。gydF4y2Ba

   答:gydF4y2Ba用于可溶性Fab的生产gydF4y2Ba通过大肠杆菌gydF4y2Ba系统中，由于用于噬菌体展示的pCDisplay-8载体不适合抗体表达（pCDisplay-8中的启动子是lac，不是强启动子），我们建议您将Fab盒构建到另一个具有强启动子的表达载体，如T7，以获得更好的产率。pCDisplay-8中Fab盒和相应元件（如VLCK/CL、VHCH1、His标签和Myc标签）的完整序列可通过图书馆手册的附录2至5找到。您可以随意设计引物，以放大进一步测试所需的区域。gydF4y2Ba

10. 问:我们在扩增辅助噬菌体M13KO7时遇到了问题。关于这个辅助噬菌体有更详细的描述吗?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2BaM13KO7是一种M13衍生物，在gII中携带Met40Ile突变，复制源为P15A和KangydF4y2Ba^RgydF4y2Ba来自Tn903的基因均插入M13复制原点内。M13KO7在没有噬菌体DNA的情况下也能复制。在含有野生型M13或f1来源的噬菌体时，优先包装单链噬菌体并分泌到培养基中。gydF4y2Ba

    对于M13KO7的放大，需要注意几点:gydF4y2Ba

    1.扩增前检查M13KO7的活性。用不同稀释度的M13KO7噬菌体在37°C下感染对数期TG1细菌细胞30分钟，并在顶部琼脂中接种到2TY平板上，以检查是否能形成噬菌体斑。gydF4y2Ba

    如果没有，辅助噬菌体股票将被灭活。虽然M13KO7辅助噬菌体在4°C或-80°C处稳定，但过多的冻融循环可能会损害辅助噬菌体的感染能力。gydF4y2Ba

    2.使用新鲜噬菌体菌斑和新鲜TG1细菌细胞进行扩增。gydF4y2Ba

    3.确保KAN工作，浓度适当（50μg/ ml）。减少或增加浓度可能导致噬菌体颗粒少。gydF4y2Ba

11. 问:为什么一些肽抗体不能与天然蛋白结合?gydF4y2Ba

    答:gydF4y2Ba天然蛋白有线性和构象的表位，而多肽极有可能具有线性结构。用于免疫原的肽的氨基酸序列是实现这一目的的关键一步。vwin创意生物实验室将帮助我们的客户选择最佳的候选肽序列作为免疫原。此外，建议从给定的蛋白链中提取多个肽，以提高天然蛋白结合的成功率。gydF4y2Ba