vwin具有广泛的经验，为治疗和诊断发育提供抗体人化服务。在过去的十年中，我们在过去的十年中成功地进行了15名鼠标/大鼠人类化项目，至少有一个人源化抗体进入临床试验。我们还向衍生自其他物种的抗体提供人类化服务，例如非人类灵长类动物（NHP），兔子，狗，鸡，骆驼等。
人性化对于降低衍生自卵烯烃源（通常啮齿动物）的单克隆抗体的免疫原性是重要的，并且用于改善其活化的人免疫系统的活化。由于杂交瘤技术的发展，已经产生了大量具有治疗利益的抗原特异性的啮齿动物单克隆抗体。啮齿动物抗体在人体中是高度免疫原性的，这限制了它们的临床应用，尤其是当需要重复的给药时。重要的是，它们迅速从循环中脱离，并且也可以引起全身性炎症效应。作为一种避难所存在这些问题的方法，我们开发了三种抗体人源化策略，其可以保护抗体对抗原的特异性和亲和力，而显着或完全消除人类抗体的免疫原性。第一种方法是CDR嫁接，第二种方法是链式洗牌。这两种方法都是基于人源化SCFV变体的噬菌体展示和通过生物淘选选择高亲和力的人源化粘合剂。第三种方法，人源化IgG库筛查，是某种方式。我们将制作一个人源化的整体IgG，以显示在哺乳动物细胞表面上，然后通过FACS对高亲和力粘合剂进行分类。
CDR嫁接和SDR嫁接
我们已经建立了CDR（互补性确定区域）接枝平台，其使用噬菌体展示技术和计算机建模一小组框架残渣的随机化。在该平台中，将包含抗原结合位点的六个CDR环接收到相应的人框架区域。不幸的是，啮齿动物CDR进入人类框架的简单嫁接并不总是重构原始抗体的结合亲和力和特异性，因为骨架残余物在间接地参与抗原结合，间接地通过支持CDR环的构象，或通过直接通过接触来重构抗原。因此，我们开发了一种计算机建模方法，以便除了CDR嫁接外还随机化某些框架残渣。将接枝的CDR与随机化残基一起克隆到噬菌体显示文库中，并通过筛选文库选择具有最佳亲和力的人源化抗体。该方法允许保留原始抗体的表位特异性。注意，由于CDR区域仍然是啮齿动物来源，因此这种方法的人性化不是100％。
为了减少CDR接枝的人源化抗体的免疫原性，通过SDR移植，CDR接枝的人源化抗体中的鼠含量最小化。在每个CDR内，有更具可变的位置，可直接参与与抗原的相互作用，即特异性确定残留物（SDR），而存在更保守的残留物，以保持CDR循环的构象。可以从抗原抗体复合物的3D结构和/或CDR的突变分析中鉴定SDR。通过将SDR接枝和将CDR的构象的残基构成SDR接枝的人源化抗体构建，并通过用父母抗体免疫的患者测量与血清的反应性来评估其免疫原性潜力。
链转移
我们还优化了一种基于构建和筛选两种嵌合噬菌体展示文库的完全选择性的人性化战略。在这种方法中，首先在我们经过良好测试的人抗体文库中的轻链替换啮齿动物抗体的轻链;然后通过将所得的杂交抗体文库筛选在特定的抗原上筛选。之后，所选杂交抗体的重链被人抗体文库的重链替代。该二次嵌合文库的后续筛选将产生完全人源化的抗体。由于噬菌体显示库筛选模仿体内抗体选择和进化过程，链洗片可以导致人源化抗体，其亲致抗体高于原始抗体的抗体。此外，该序贯链切换程序可以产生具有不同序列的若干版本的人源化抗体。多种人源化抗体的生产在治疗方案中是重要的，所述治疗方案是呼吁通过施用替代抗体来避免抗独立抑制反应的抗体的长期处理。
如上所述，基于嵌合噬菌体展示文库构建和筛选的“链洗脱”方法允许全部，即小鼠抗体的100％人化。我们想建议使用我们的HUSCL-2TM噬菌体展示幼稚人scFv文库，其复杂性为1.42×109.转化体作为嵌合文库的骨干和人类的供体L.和V.H链。
人源化IgG库筛查
在这种方法中，制作了一个哺乳动物细胞表面显示库，以显示使用FACS进一步选择的全尺寸人源化IgG变体。首先，我们将选择一个受体人类VH和一个受体vL.基于一致序列的人类抗体亚群。接下来，按照上述方法进行CDR嫁接。为了增加(或保持)人源化抗体的亲和力，创建了一个哺乳动物细胞表面显示IgG库，以显示所有可能的人源化IgG变体。由于哺乳动物细胞表面显示的IgG文库的大小限制，必须决定哪些氨基酸要多样化，以及在何种程度上要多样化，以减少浪费文库容量的无意义抗体突变。基于计算机建模或抗原/抗体结构信息设计框架区域的反向突变。此外，我们将区分具有溶剂可接近侧链的残基和那些有埋藏侧链的残基。我们已经证实，随机化带有埋藏侧链的残基是对库序列空间的浪费。此外，我们不改变甘氨酸和色氨酸，因为这些残基的变化通常会破坏结合。有时，我们研究亲本抗体的AA序列，以找出保守的框架位置(与种系和抗体亚家族序列比较)。然后我们可以将突变引入到框架工作区域中不保守的位置。 Supposedly, these regions will be antigen-specific and change in these regions may increase affinity but not immunogenicity. In order to create a largest possible library, trimer codon technology is employed to randomize those defined framework residues on both humanized heavy-chain and humanized light-chain.
最后，创建了人源化IgG库，其中重链变体的cDNA（用三聚密码子随机化的位置）被克隆到哺乳动物细胞表面显示载体中，而轻链变体的cDNA插入a中单独的哺乳动物表达载体以自由表示（不膜锚定蛋白）。然后将重链文库和轻链文库的cDNA混合并转染到293个细胞中，以进行功能整体尺寸的IgG变体的表面显示。然后通过FACS对顶部粘合剂进行排序。在严格选择之后，一部分ELISA正突变体粘合剂将具有比亲本抗体更高的亲和力。阳性克隆的亲和力将使用表面等离子体共振仪Biacore排名。然后表达和纯化前3-5个克隆以测量亲和力。
这种方法允许选择全尺寸IgG格式的人源抗体，保留或增加小鼠抗体的原始亲和力。此外，与上述基于细菌噬菌体展示的方法相比，这种哺乳动物细胞表面展示方法允许以二聚体IgG格式选择高亲和力的人源抗体;所选的IgG对进一步的下游应用非常有利，避免了将scFv转化为IgG和对转化后的IgG密码子进行优化(用于在哺乳动物细胞中表达)的耗时，有时会导致一些人源化的scFv被取消选择。此外，一些好的抗体具有阻止细菌细胞中蛋白质合成和噬菌体展示的序列;这些问题可以很好地克服在这个专门的哺乳动物细胞为基础的系统。
我们人性化服务的特点
我们的抗体人类化服务中有两种功能，从我们的同龄人中占有一员。首先，抗体亲和力成熟是我们人源化程序的综合步骤，因此无需改善人化后的亲和力。其次，除了普通的计算和生化方法外，我们还开发了专有的体内评价制灵脂盐中人源化抗体免疫原性的方法。在灵长类动物中测量的免疫原性是最接近人类型抗体在人类中的真正免疫原性的免疫原性。
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